蒙药定性砂蓝三刺头究与定量质量控法研制方

2.4.4 线性关系考察

用70%甲醇对贮备液进行逐级稀释，蒙药得到2.024、砂蓝20.240、定性定量50.600、质量101.200、控制151.800μg/m L的研究系列对照品溶液，分别精密吸取溶液各10μL，蒙药注入色谱仪进行测定，砂蓝以对照品的定性定量进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），质量进行线性回归，控制得标准曲线方程为Y=35.919 X-4.386 4,研究r=1.000 0，结果表明，蒙药MMQ在2.024～151.800μg/m L线性关系良好。砂蓝

2.4.5 定量限和检测限

取对照品贮备溶液，定性定量逐步稀释，按“2.4.1”项下色谱条件进样，进样量为10μL，信噪比（S/N）为10∶1，测得MMQ的定量限约为2.024μg/m L。信噪比（S/N）为3∶1时，MMQ的检测限约为0.607μg/m L。

2.4.6 精密度试验

选取高、中、低（101.200、50.600、20.240μg/m L)3个质量浓度的对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件下同1 d内连续进样6次，测得MMQ峰面积的RSD分别为0.73%、0.95%、1.37%。连续测定3 d，每天进样1次，记录MMQ峰面积，测得MMQ峰面积的RSD分别为2.06%、1.61%、1.88%。结果显示日内、日间精密度均小于3%。表明日内、日间精密度良好，仪器稳定。

2.4.7 重复性试验

取样品粉末0.25 g(S5），按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.4.1”项下色谱条件进样，进样量为10μL，记录MMQ的峰面积。采用外标一点法计算MMQ的含量，样品中MMQ的质量分数为5.28 mg/g,RSD为1.37%，表明此方法重复性好。

2.4.8 稳定性试验

取样品粉末0.25 g(S5），按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样，进样量为10μL，结果显示MMQ峰面积的RSD为1.81%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的EGT粉末0.125 g(S5）精密称定，按已测定的50%、100%、150%精密加入对照品溶液，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，采用外标一点法计算加样回收率。结果MMQ的平均加样回收率为101.5%,RSD为1.46%。

2.4.1 0 定量测定

取7批EGT样品，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样，经HPLC测定后，结果显示7批EGT(S8、S9因采集时间较久，未测定）的质量分数范围在0.13%～0.53%，见表1。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

EGT为蒙古族习用药材，目前无相关的质控标准以及专属性成分的研究，本研究通过MCI色谱、硅胶色谱、高效液相色谱等分离手段，得到专属性成分，经核磁鉴定为一种喹啉酮类生物碱（MMQ）。本实验将EGT与其它4种近源样品：大蓝刺头、硬叶蓝刺头、全缘蓝刺头和蓝刺头，进行薄层色谱和HPLC检测比较，结果显示大蓝刺头、硬叶蓝刺头、全缘蓝刺头不含有MMQ，在蓝刺头样品中虽含有少量MMQ，但远低于其检测线。因此MMQ作为砂蓝刺头中含量较高且专属性较强的成分，建立以其为指标成分定性定量方法，有一定的科学性与实用性，可以更好地评价EGT药材的质量。

3.2 薄层色谱鉴别

在薄层鉴别展开剂的考察中，发现酸对于薄层展开体系的影响较大，非酸体系下，斑点较少、分离度较差。筛选了多种显色剂，包括磷钼酸、碘化铋钾、碘、10%硫酸乙醇等，显色效果均不佳，不显色或者显色不灵敏，最终定为以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（6∶1∶1∶0.8）为展开剂，254 nm紫外灯下检视荧光斑点即可。比较了不同厂家的薄层板：银龙-HSGF254板、黄海-HSGF254板、德国MNSGF板和德国MNHSGF板，所建立的薄层方法在上述几种板中均能获得很好的展开效果，其中以德国MNHSGF板分离效果最好。

3.3 指纹图谱建立

中药色谱指纹图谱能够较为全面地反映中药的整体质量。本实验建立指纹图谱分析方法能很好地将EGT与同属其他植物相区别。相似度分析评价中，S9（批号20120815）相似度仅为0.679，其他EGT样品相似度均高于0.9，这提示EGT样品陈置过久可能会影响其药材质量。这一发现为药材市场中EGT药材年限控制提供数据参考。不同来源的9批样品指纹图谱中的共有峰在数目以及相对保留时间上保持一致，但各共有峰相对峰面积有一定的差异，说明各批次药材之间的质量存在差异，推测可能与药材产地、生长年限、采收期等因素有关。将EGT和其他种蓝刺头的指纹数据进行统计分析，主成分分析和聚类分析结果一致，均能实现EGT与同属其他植物（蓝刺头、全缘叶蓝刺、硬叶蓝刺头和大蓝刺头）的区别。在PCA中，16批样品聚为2大类，S1～S9号样品为不同批次EGT,S10～16号样品为蓝刺头属其他种样品，其中S8和S9号样品为2012年收集的样品，虽经放置多年，成分有所下降，但仍归为EGT中。在聚类分析中，S8和S9号样品处于同一组中；S14和S15号样品为全缘蓝刺头也在同一组中，该结果与OPLS-DA结果一致。

3.4 含量测定

在建立MMQ的定量分析方法实验中，进行了提取方法（超声、加热回流）、提取溶剂（纯甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、提取时间和提取次数的考察。最终确定的提取方便操作简单、省时，对砂蓝刺头中MMQ提取率高。考察了乙腈-水、乙腈-醋酸铵缓冲盐水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流动相体系对液相色谱分离效果的影响。最终确定的含测方法重复性好，MMQ的分离度和含量测定RSD均符合检测要求。另外，由于S8和S9药材采集时间过久，为了不影响含量限度制定的准确性，未对这2批药材进行含量测定。

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